双标多重免疫荧光试剂盒(冰冻切片)

产品介绍

酪酰胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification, TSA）主要是利用酪胺的过氧化物酶反应。酪胺非活性荧光素底物在HRP和过氧化氢的作用下，会被激活产生活化荧光底物，同时形成共价键结合位点，共价结合在蛋白抗原表面或附近的酪氨酸残基上，抗原和抗体的结合部位就会有大量的酪胺荧光素沉积，使抗原位点处的荧光信号增强。

酪胺荧光素底物-抗原酪氨酸共价稳定结合，故TSA信号不会受微波影响，可用热修复法清除第一轮与抗原非共价结合的抗体复合物(冰冻切片，细胞爬片样本请试用抗体洗脱液洗脱法清除)，并能在抗体去除后保留与抗原相关的荧光信号。然后，再用第二种一抗进行第二轮孵育，同时更换另一种酪胺荧光素底物，多次循环反复，不同的酪胺荧光素进行标记就可实现多重免疫组化染色。

产品组成成分

保存条件

荧光染料 -20℃避光保存，12个月

内源性过氧化物酶阻断剂、超敏酶标山羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物 4℃避光保存，12个月

抗体洗脱液 RT 保存，12个月

实验前材料准备

1、PBS缓冲液、柠檬酸钠抗原修复液（或其他修复液）；

2、推荐可用于IHC-P的单克隆抗体；

3、DAPI染色液（推荐浓度：5μg/mL 货号：AWC0298）

操作步骤

1、操作流程简图

2、详细操作步骤

(1) 冰冻切片准备：冰箱取出冰冻切片恢复至室温晾干水分后固定10-30min，PBS 洗 5min 重复 3 次。

(2) 切片破膜：滴加破膜液通透 20 min，PBS 洗 5min 重复 3 次。

(3) 抗原修复：切片置于盛满 EDTA 抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中 60℃水浴 30min，自然冷却，PBS 洗 5min 重复 3 次（此步骤可选做，修复有助于暴露抗原和去除内源性过氧化物酶）。

(4) 阻断内源性过氧化物：切片放入内源性过氧化物酶阻断剂，室温避光孵育 15 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

(5) BSA 封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5% BSA-PBS（或者其他封闭液）均匀覆盖组织，室温封闭 30min。

(6) 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗 X，切片平放于避光湿盒内    4℃孵育过夜或者 37℃ 1-2h。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

(7) 加免疫组化 HRP 二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的免疫组化 HRP 二抗覆盖组织，避光室温孵育 30-50min，PBS 洗三次。

(8) 荧光染料反应：TSA-520 荧光染料反应 3-10min，PBS 洗三次。

(9) 上一轮抗体洗脱：滴加适量 37℃ 预热至完全溶解的抗体洗脱液覆盖样本，37℃ 放置 5-20 分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本 37℃ 放置 5-20 分钟，弃洗脱液，PBS 洗三次，每次 5 分钟。

    (10)重复 4-9 步骤（换用另外一种 TSA-XXX 荧光染料）。

    (11)DAPI 复染细胞核：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10min。

(12)封片：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

(13)镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

注意事项

1、试剂初次使用前请置于4℃解冻，解冻后于4℃短期保存，避免反复冻融，请尽快使用。

2、为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

   3、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。