1) 取出爬片，PBS清洗2~3次；
2) 将爬片用4%多聚甲醛固定30分钟；
3) PBS冲洗5 min x 3次；
4) 加入0.3%曲拉通，37℃30 分钟通透。PBS冲洗3 min x 3次；
5) 5%BSA37℃封闭60分钟；PBS冲洗3 min x 3次；
6) 孵育一抗：滴加适当稀释的一抗（SIRT3；AWA10553），4℃过夜。PBS冲洗5 min x 3次；
7) 孵育二抗：滴加50~100ul抗-Rabbit-IgG标记荧光抗体（Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488；AWS0003），37℃孵育90 min，PBS冲洗5 min x 3次；
8) DAPI工作液37℃染核10 min，PBS冲洗5 min x 3次；
9) 缓冲甘油封片；
10) 避光保存，或到荧光显微镜下观察。
原理：蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
流程图：
蛋白提取 → 浓度测定 → 电泳 → 转膜 → 封闭 → 一抗二抗孵育 → 曝光
一、蛋白提取（以细胞样品为例）
1. 用冰预冷PBS洗涤细胞一次，加入200 uL RIPA裂解液（AWB0139），用细胞刮刀刮下细胞，收集悬液，超声破碎1.5min。
2. 冰上，裂解10分钟；
3. 4℃，12000 rpm离心 15 min。（提前开离心机预冷）
4. 将离心后的上清转移倒 1.5mL的离心管中备用；
二、蛋白浓度测定
按照BCA蛋白定量试剂盒（AWB0104）使用说明操作，测定蛋白浓度。
1. 配制BCA工作液：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 配制标准品：标准品用RIPA裂解液（或者和待测样品一致的稀释液）按照50%梯度稀释。
3. 按照BCA蛋白定量试剂盒操作步骤进行到测定，并根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度
三、电泳
1. 根据目的蛋白分子量(MW）配制SDS-PAGE胶备用。
2. 在EP管中制备样品。按照蛋白样品和蛋白上样缓冲液（AWB0055）按4:1混合，沸水煮5min，以充分变性蛋白，放入冰盒中速冷备用。
3.上样：左边第一孔加入蛋白marker（AWB0236） 2 uL，其它每孔上样10-20 uL。以蛋白定量结果为准，使每个孔总蛋白质量统一为20~40ug。
4. 开始电泳，电泳恒定电压80V，直至蛋白质迁移出浓缩胶区域， 再将电压调至 140V，继续电泳直至溴酚蓝迁移到分离胶底部 0.5cm处，关闭电源。
四、转膜
1. 按照分子量分别切胶，并裁剪好转膜用的滤纸和NC膜，浸泡在1X电泳缓冲液中（AWB0083）
2. 按照3张滤纸+NC膜+胶+另3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。
3. 盖上仪器，接通电源，300 mA恒定电流转膜，根据蛋白分子量大小确定转膜时间，比如内参actin，42kDa 转膜60min。
4. 转膜完毕后，将膜取出放入1*TBST（ AWB0191）中洗1次。
五、封闭
将膜取出后，浸入Western封闭液（ AWB0202）中，摇床上室温摇晃封闭60min。
六、一抗二抗孵育
1. 根据抗体推荐稀释比例，用抗体稀释液（AWB0200）稀释一抗，将膜与一抗一起孵育，4℃过夜
2. 第二天，取出，室温恢复30min。
3. 1*TBST洗3次，每次10min。
4. 用1*TBST稀释HRP标记的二抗 ，将稀释后的二抗与膜共同室温孵育90min。
5. 孵育结束，1*TBST洗3次，每次15min。
七、显色曝光
1. 配制ECL发光液工作液：根据ELC发光液试剂盒（ AWB0005）操作说明配制工作液
2. ECL显色曝光：使用ECL化学发光液与膜充分反应，用滤纸吸尽多余液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，凝胶成像系统成像。
IHC-P（石蜡切片免疫组化）步骤
一、脱蜡
1) 60℃烤片12 h；
2) 切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇浸泡，每次浸泡5 min。再用蒸馏水浸洗5 min 1次；
二、抗原修复
3) 热修复抗原：将切片浸入柠檬酸修钠抗原修复液中（AWI0206）, 微波炉加热至沸腾后断电，低火煮20min后，冷却20min后拿出，继续冷却至室温。冷却后0.01M PBS（pH7.2~7.6）洗涤3 min x 3次；
4) 加入1%高碘酸（AWI0186）或者3%双氧水，室温浸泡10 分钟以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min x 3次；
三、免疫组织化学染色
5) 取出片子，甩干，擦净水分，滴加适量3% BSA，室温湿盒中封闭1小时；
6) 孵育一抗：吸水纸吸去多余液体（此时注意不要干片），滴加适量稀释后的一抗（通用型抗体稀释液：AWT0199），室温湿盒孵育1小时或者4℃过夜。
7) PBS冲洗5 min x 3次；
8) 孵育二抗：甩干，擦净水分，滴加适量（50ul~100ul）二抗（AWI0722，AWI0723）37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min x 3次；
9) DAB显色：甩干，擦净，滴加预制好的显色剂DAB（AWB0175）工作液50~100 μL，室温孵育0.5~5 min， 镜下观察控制反应时间直至显色至预期深浅。（DAB工作液现配现用）
10) 甩干，擦净，蒸馏水洗涤3次，1min/次；
11) 苏木素（AWI0009）复染5~10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；
12) 各级酒精（60%，80%，95%，100%）脱水，每级浸泡5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次
13) 从二甲苯中取出切片，中性树胶封片、显微镜观察。
